O consumo regular de chá verde

O consumo regular de chá verde influencia a expressão do fator de crescimento endotelial vascular e seu receptor no tecido erétil de ratos idosos? 

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Abstrato

A disfunção erétil (DE) é uma doença altamente prevalente que afeta milhões de homens em todo o mundo, com tendência a um aumento generalizado. A DE é agora considerada uma manifestação precoce da aterosclerose e, consequentemente, um precursor da doença vascular sistêmica. A aterosclerose e a DE compartilham fatores de risco potencialmente modificáveis, como fumar ou ingestão de alimentos com alto teor de gordura, mas não está claro como o consumo regular de bebidas ricas em antioxidantes, que exibem características anti-ateroscleróticas reconhecidas, afeta a progressão da DE. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos moduladores do consumo crônico de bebidas ricas em catequina na estrutura vascular do corpo cavernoso de rato e como isso poderia contribuir para retardar ou prevenir o aparecimento de DE. Ratos Wistar machos com 12 meses de idade foram tratados com chá verde (GT) ou uma solução de extrato de chá verde (GTE) como a única fonte líquida por 6 meses. O consumo de GT e GTE levou à diminuição dos níveis plasmáticos de androgênio, sem qualquer alteração significativa nos níveis lipídicos plasmáticos. Foi observada uma redução no armazenamento intracelular de lipídios do corpo cavernoso, associada à diminuição da expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e de seu receptor VEGFR2 nas células endoteliais. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem diminuição da progressão aterosclerótica no tecido cavernoso. No entanto, estudos funcionais serão necessários para elucidar se as bebidas ricas em catequina são compostos úteis na prevenção de eventos vasculares deletérios associados à disfunção erétil. Também foi demonstrado que o consumo regular de catequinas reduz a progressão aterosclerótica e a mortalidade devido a doenças cardiovasculares. Os resultados aqui relatados sugerem uma progressão aterosclerótica diminuída no tecido cavernoso em ratos idosos após a ingestão crônica de bebidas ricas em catequina.

Palavras-chave: Envelhecimento, Catequinas, Disfunção erétil, Testosterona, VEGF, Receptores VEGF
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Introdução

A disfunção erétil (DE) é uma doença altamente prevalente que afeta milhões de homens em todo o mundo, com tendência a um aumento generalizado (Ayta et al. 1999 ). Por muitos anos, a DE foi vista como uma complicação relacionada à idade de doenças cardiovasculares, diabetes mellitus e hipertensão arterial, mas essa disfunção agora é considerada uma manifestação precoce da aterosclerose e, consequentemente, um precursor da doença vascular sistêmica (Cheitlin 2004 ). Portanto, vários autores consideram que todos os homens com disfunção erétil devem ser considerados em risco de doença cardiovascular até prova em contrário (Blumentals et al. 2004 ; Vlachopoulos et al. 2005 ).

Os pequenos vasos do pênis são muito sensíveis a mudanças estruturais e funcionais (Kaya et al. 2006 ). O DE vasculogênico, que ocorre em dois terços dos casos, inclui o DE arteriogênico (insuficiência da artéria cavernosa) e o DE veno-oclusivo, que são comumente discutidos separadamente, mas geralmente coexistem no mesmo paciente (Azadzoi 2006 ). O DE vasculogênico é freqüentemente causado por comprometimento vascular associado ao relaxamento do músculo liso cavernoso, que é considerado uma disfunção endotelial (Goldstein 2003 ; Guay 2007) e a conexão etiológica entre DE e doença vascular sistêmica. A disfunção endotelial é definida como incapacidade de vasodilatação de maneira dependente do endotélio, e é devida à biodisponibilidade prejudicada de óxido nítrico (NO) que normalmente está associada à síntese diminuída de NO ou à sua degradação aumentada no músculo liso perivascular. Além disso, o NO endotelial exerce especificamente efeitos vasoprotetores, impedindo o desenvolvimento de aterosclerose e diminuindo o risco cardiovascular (Busse e Fleming 1996 ; Gewaltig e Kojda 2002 ).

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O déficit angiogênico cavernoso também contribui para a DE, e foi demonstrado que a injeção intracavernosa do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o principal fator de crescimento angiogênico, facilita a recuperação da função erétil em modelos experimentais de DE em ratos (Lee et al. 2002 ; Gholami et al. 2003 ; Rogers et al. 2003 ; Park et al. 2004 ). Por outro lado, o DE vasculogênico associado à aterosclerose dos corpos cavernosos pode ser considerado uma patologia de hipóxia / isquemia propriamente dita, atuando assim como um indutor de angiogênese (Egami et al. 2006 ).

A patologia subjacente à doença cardiovascular é geralmente a aterosclerose, que se desenvolve gradualmente ao longo dos anos antes de se manifestar como DE, ataque cardíaco ou derrame (Jackson 2004 ). A própria aterosclerose está fortemente relacionada a fatores de risco, como hipertensão, alto consumo de gordura, tabagismo e colesterol alto (De Backer et al. 2003 ). Os mesmos fatores de risco também estão associados a um risco aumentado de progressão de DE (Esposito e Giugliano 2005 ; Bacon et al. 2006 ; Greenfield e Donatucci 2007 ). O mecanismo por trás da ação de fatores tão diferentes não é conhecido, mas existe uma forte crença de que as espécies reativas de oxigênio desempenham um papel importante (Halliwell e Gutteridge, 1999).), sugerindo que os antioxidantes podem ter efeitos protetores nessa situação. De fato, verificou-se que a ingestão de suco de pomegrato, uma bebida rica em antioxidantes, preservava a função do tecido erétil e evitava fibrose cavernosa na DE arteriogênica em coelhos jovens (Azadzoi et al. 2005 ).

O chá verde (GT), obtido a partir da infusão de folhas de Camellia sinensis não fermentadas , é uma bebida natural enriquecida com antioxidantes que contém níveis substanciais de catequinas. As catequinas são flavonóides pertencentes a uma família de compostos polifenólicos, dos quais os membros mais abundantes no GT são epicatequina (EC), epicatequina-3-galato (ECG), epigalocatequina (EGC) e epigalocatequina-3-galato (EGCG). A ingestão regular de GT (Riemersma et al. 2001 ; Stoclet et al. 2004 ; Kavantzas et al. 2006 ) ou extrato de chá verde (GTE) (Bursill et al. 2007 ) levou a uma redução no colesterol plasmático e uma diminuição na aorta placas de aterosclerose em animais experimentais alimentados com colesterol (Muramatsu et al. 1986) O consumo de GT também impediu a dislipidemia e a progressão da disfunção cardíaca em ratos diabéticos (Anandh Babu et al. 2006 ). Em seres humanos idosos, o consumo de GT foi associado à função endotelial melhorada (Woo et al. 1997 ) e à redução da mortalidade por doenças cardiovasculares (Kuriyama et al. 2006 ), o que dá suporte à existência de um forte efeito vasculoprotetor. A proteção proporcionada pelo consumo de GT pode ser devida a um aumento no potencial antioxidante plasmático (Tijburg et al. 1997 ; Zhu et al. 1999 ), mas a diminuição da expressão de VEGF em placas ateroscleróticas aórticas após a ingestão de GT (Kavantzas et al. 2006) sugere a intervenção de um mecanismo antiangiogênico adicional.

Assim, levantamos a hipótese de que uma melhora da função vascular associada à catequina e o efeito antiaterosclerose poderiam atrasar ou até impedir o aparecimento de DE relacionada à idade. Tais ações podem ocorrer devido à modulação da atividade do VEGF. Até onde sabemos, é a primeira vez que o tecido cavernoso é estudado em animais idosos após a ingestão crônica de soluções naturais ricas em catequina.

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materiais e métodos

Animais

Trinta ratos Wistar, machos, com 12 meses de idade (Charles River Laboratories, Barcelona, ​​Espanha), pesando 893 ± 104 g, foram alojados individualmente e mantidos sob um ciclo claro-escuro de 12 horas e temperatura padrão (20–22 ° C) com acesso gratuito a alimentos e a uma fonte líquida. Os ratos foram separados aleatoriamente em três grupos, cada um composto por 10 ratos: (1) animais controle (C) com acesso à água da torneira; (2) animais tratados com chá verde (GT) que receberam uma infusão de GT preparada com três saquinhos de chá (Lipton, 1,3 g / sac) em um litro de água fervente por 5 minutos como a única fonte líquida disponível; e (3) GT ratos tratados com extrato (GTE) com acesso livre a uma solução aquosa contendo catequinas de 200 mg / l extraídas de GT, mas com baixo conteúdo de EGCG. A composição da catequina do GT foi a seguinte: EGCG 439,2 mg / l, (-) – epicatequina (CE) 264,1 mg / l, galocatecina-3-galato (GCG) 32. 1 mg / le ECG 97,3 mg / l, numa concentração total de catequina de 832,7 mg / l. A solução de GTE compreendeu 7,6 mg / l de EGCG, 111,9 mg / l de EC, 18,8 mg / l de GCG e 61,7 mg / l de ECG.

Durante os 6 meses de tratamento, todos os ratos tiveram acesso a ração animal de laboratório padrão (Letica, Barcelona, ​​Espanha). Garrafas contendo as bebidas foram protegidas da luz para evitar a oxidação de componentes sensíveis à luz e as bebidas foram renovadas a cada 2-3 dias. A ingestão ad libitum de alimentos e líquidos foi monitorada a cada dois dias e o peso do animal foi registrado a cada semana. Todos os procedimentos com animais seguiram as diretrizes da Comunidade Européia (86/609 / EEC) e a Lei Portuguesa (129/92) para o uso de animais experimentais.

Coleta e preparação de tecidos

No final do tratamento, todos os animais foram anestesiados (pentobarbital de sódio; 80 mg / kg de peso corporal, ip), o sangue foi retirado do ventrículo esquerdo para tubos heparinizados e as frações do plasma foram congeladas a -80 ° C, até a análise. Os pênis foram dissecados da pele e da gordura circundante e excisados.

Análise bioquímica

A testosterona plasmática foi medida por radioimunoensaio usando anti-soro contra testosterona e 125I -testosterona (Testo-RIA-CT, Biosource Europe, Nivelles, Bélgica). As concentrações de colesterol plasmático, triglicerídeos e colesterol HDL foram determinadas por testes colorimétricos enzimáticos, utilizando kits comercialmente disponíveis (Colesterol, Triglicérides, HDL Cholesterol Direct, ABX Diagnostics, Shefford, Reino Unido), em auto-analisador (Cobas Mira Plus, ABX Diagnostics).

Imuno-histoquímica

Os fragmentos do pênis foram fixados em formaldeído tamponado a 10% por 24 horas e embebidos em parafina, orientados ao longo do eixo transversal. Secções, 5 mm de espessura, foram cortados com um micrótomo Leica RM2145 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e colocados em 0,1% de poli- llâminas de microscopia revestidas com isquina para imunocoloração. As seções foram desparafinizadas, hidratadas, tratadas com peróxido de hidrogênio a 3% em metanol para bloquear a atividade endógena da peroxidase, expostas a HCl 1 M por 30 min para recuperação de epítopos e neutralizadas com bórax por 5 min. Todas as lâminas foram incubadas durante a noite com anti-VEGF de cabra (1/20 diluído, R&D Systems, Minneapolis, MN), anti-VEGFR1 de cabra (diluído 1/200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e anti-VEGFR2 de coelho Anticorpos policlonais primários (diluídos 1/500 da Santa Cruz Biotechnology). Após 30 min de incubação com o anticorpo secundário biotinilado e estreptavidina-peroxidase de rábano complexo (Vectastain, Vector, Burlingame, CA), os cortes foram feitos reagir simultaneamente com tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina / H 2 O 2durante o mesmo período e contra-corada com hematoxilina. Todas as lâminas foram examinadas usando um microscópio de campo claro da Nikon e imagens obtidas em um filme colorido 100 ASA.

Imunofluorescência

Também foi realizada a detecção por imunofluorescência de VEGF / VEGFR1 e VEGFR1 / VEGFR2, começando com uma mistura de anti-VEGFR1 de coelho (Lab Vision Corporation, Fremont, CA) com anti-VEGF de cabra (R&D Systems) ou anti-VEGFR2 de cabra (Santa Cruz Biotechnology ) anticorpos primários, seguidos por uma mistura adequada de anticorpos secundários, anti-coelho conjugado com Alexa 488 (verde) com anti-cabra ou anti-camundongo conjugado com Alexa 568 (vermelho), ambos diluídos 1/500. As seções foram observadas em um microscópio confocal (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), estabelecido em comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 568 nm a partir de uma fonte de laser de crípton-argônio.

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